GC-MS非靶標代謝組學全面解決方案上海阿趣生物科技有限公司

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技術服務信息

服務名稱:GC-MS非靶標代謝組學全面解決方案
服務類別:科研實驗整體外包服務 - 整體實驗服務外包
價格:800元
允許參觀:不允許參觀
所在區域:上海.上海
更新時間:2019/10/17 14:29:00
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誠信指數:125點
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使用范圍:僅限科研使用,不能應用于臨床
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上海阿趣生物科技有限公司
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技術服務詳細描述


鵝血清GC-TOF-MS非靶標代謝組學檢測分析方案
一、項目簡介
1.1樣本信息

鵝血清樣品,分對照組(C)、模型組I(M1)和模型組II(M2),每組取10個平行樣品,進行GC-TOF-MS代謝組學檢測分析,并對得到數據進行進一步生物信息學分析。
樣品詳情:共計30例樣品。


1.2對比策略
針對非靶標代謝組學數據分別進行如下對比,并對得到數據進行進一步的生物信息學分析:
進行M1組 vs C組,M2組 vs C組,M2組 vs M1組共計3次對比分析。
1.3分析內容
基礎數據分析包括:數據預處理,PCA 分析(principal component analysis),正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA),差異化合物篩選和鑒定。
個性化分析:差異代謝物代謝通路分析
1.4檢測平臺
非靶標代謝組學檢測平臺:GC-TOF-MS, Pegasus HT (LECO, USA)

二、數據分析方案
基礎數據分析
2.1數據預處理
GC-MS非靶標代謝組學對原始數據進行解卷積,峰對齊,標準化分析,通過原始總離子流(TIC)色譜圖,初步觀察儀器的保留時間重現性,所測得的物質數量,以及不同組之間的色譜圖是否具有較明顯的差異。


2.2 PCA分析(principal component analysis)
對樣本進行主成分分析能從總體上反應各組樣本之間的總體代謝差異和組內樣本之間的變異度大小。軟件采用瑞典MKS DAS 公司的SIMCA14.1,數據采用UV格式化(Unit Variance Scaling)和平均中心化(Mean-Centered)處理[1],以獲得更加可靠且更加直觀的結果。軟件進行自動化模型擬合分析,獲得最可靠數學模型的主成分數目。例圖如下所示:


2.3正交偏最小二乘方-判別分析(OPLS-DA)
為了消除與分類不相關的噪音信息,同時也為了獲得導致兩組之間顯著差異的相關代謝物信息,我們采用正交偏最小二乘方判別分析(OPLS-DA)過濾與模型分類不相關信號即正交信號,獲得OPLS-DA模型。對模型的質量用交叉驗證法進行檢驗,并用交叉驗證后得到的R2X 和Q2(分別代表模型可解釋的變量和模型的可預測度)對模型有效性進行評判。在此之后,通過排列實驗對模型有效性做進一步的檢驗。
例圖如下所示:
 
[2] 載荷圖(loading plot)的橫坐標代表每個物質在第一主成分上的載荷大小(cosα),縱坐標代表每個物質在第二主成分上的載荷大小(cosβ)。

[3] 置換檢驗的橫坐標代表隨機分組的Y與原始分組Y的相關性,縱坐標代表R2和Q2的得分。
[4] ROC作為模型的一種外部檢驗,當AUC越靠近1時表示模型越可靠。

[5] S-plot的橫坐標代表每個物質在第一主成分上的載荷大小(cosα),縱坐標代表每個物質和第一主成分相關系數(可靠性)的大小。
[6] S-line的橫坐標代表每個物質的ID,縱坐標代表每個物質在第一主成分上的載荷大小(cosα),顏色代表縱坐標代表每個物質和第一主成分相關系數(可靠性)的大小。
2.4代謝物定性及差異化合物篩選
GC-MS非靶標代謝組學代謝物定性的方法為:搜索自建的標準物質數據庫和NIST商業數據庫(自動峰識別和保真解卷積®)。
我們采用 OPLS-DA模型第一主成分的VIP(Variable Importance in the Projection)值(閾值>1),并結合學生氏t檢驗(t-test)的p值(閾值≤0.05)來尋找差異性表達代謝物。

表1. GC-TOF-MS差異化合物列表(部分)

個性化分析
2.5差異代謝物KEGG注釋
生物體中的復雜代謝反應及其調控并不單獨進行,往往由不同基因和蛋白質形成復雜的通路和網絡,它們的相互影響和相互調控最終導致代謝組發生系統性的改變。對這些代謝和調控通路的分析可以更全面,更系統的了解實驗條件改變導致的生物學過程的改變,性狀或疾病的發生機理和藥物作用機制等生物學問題。
京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG) Pathway數據庫以基因和基因組的功能信息為基礎,以代謝反應為線索,串聯可能的代謝途徑及對應的調控蛋白,以圖解的方式展示細胞生理生化過程。這些過程包括能量代謝,物質運輸,信號傳遞,細胞周期調控等,以及同系保守的子通路等信息,是代謝網絡研究最常用的通路數據庫。
我們整理出差異代謝物映射的所有通路,如下表所示:

獲得上述結果后,我們將差異代謝物在KEGG通路圖上進行標記,以亮紅色代表上調,亮藍色代表下調。以Citrate cycle (TCA cycle)代謝通路為例:

圖10. 代謝通路圖,其中紅色標記的點為差異代謝物
2.6差異代謝物代謝通路富集分析
KEGG注釋分析僅找到所有差異代謝物參與的通路,但要想知道這些通路是否與實驗條件密切相關,需對差異代謝物進行進一步的代謝通路富集分析。通過對差異代謝物所在通路的綜合分析(包括富集分析和拓撲分析),我們可以對通路進行進一步的篩選,找到與代謝物差異相關性最高的關鍵通路。
代謝通路富集分析的結果以氣泡圖進行展示。氣泡圖中每一個氣泡代表一個代謝通路,氣泡所在橫坐標和氣泡大小表示該通路在拓撲分析中的影響因子大小,大小越大影響因子越大;氣泡所在縱坐標和氣泡顏色表示富集分析的P值(取負常用對數,即-log10 P-value),顏色越深P值越小,富集程度越顯著。我們對富集分析和拓撲分析綜合考慮后凸顯出重要性的通路進行了標注,幫助客戶深入理解分析結果。
 
 圖11. 代謝通路富集分析氣泡圖

三、時間概算
非靶標代謝組學實驗檢測:22個工作日(從收到客戶預付款并收到樣品之日起)
非靶標代謝組學數據分析:10個工作日

 

 代謝組學是繼基因組學和蛋白質組學之后新近發展起來的一門學科,是系統生物學的重要組成部分。基因組學和蛋白質組學分別從基因和蛋白質層面探尋生命的活動,而實際上細胞內許多生命活動是與代謝物相關的,如細胞信號(cell signaling)、能量傳遞等都是受代謝物調控的。代謝組學正是研究代謝物——在某一時刻細胞內所有代謝物的集合——的一門學科。基因與蛋白質的表達緊密相連,而代謝物則更多地反映了細胞所處的環境,這又與細胞的營養狀態、藥物和環境污染物的作用,以及其它外界因素的影響密切相關。因此 Bill Lasley(UC Davis)認為基因組學和蛋白質組學能夠說明可能發生的事件,而代謝組學則反映確實已經發生了的事情。

新陳代謝網絡是十分復雜的網絡,特別是人體的代謝網絡,一直被認為是最復雜的代謝網絡。現在多數信號通路的研究都是集中在代謝網絡的一個很小的領域。基因組學、蛋白組學研究已經揭示了部分調節通路,但是和代謝網絡直接相關的是代謝產物。
 

 

 

 

 

 

 

 


但是從茫茫多的代謝產物中選取研究對象,無疑是大海撈針。代謝組學研究通過一定的手段能夠幫助研究員從代謝產物海中挑出來,提供一個“航拍”的視角,一目了然地發現差異性代謝產物。然后通過已知的代謝通路逆推找出調節酶和基因,完成疾病發病機制、藥物治療機制等方面的研究。
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


代謝組學主要研究的是作為各種代謝路徑的底物和產物的小分子代謝物(MW<1500)。其樣品主要是血漿或者血清、尿液、唾液、以及細胞和組織的提取液,以及細胞和組織的提取液。主要技術手段是核磁共振儀(NMR)、液相色譜質譜聯用(LC-MS)、氣相色譜質譜聯用(GC-MS)、色譜(HPLC、GC)等。通過檢測一系列樣品的譜圖,再結合化學模式識別方法,可以判斷出生物體的病理生理狀態,基因的功能,藥物的毒性和藥效等,并有可能找出與之相關的潛在生物標記物(potential biomarkers)。

 

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